超分辨率顯微鏡在腎臟成像中的應用和原理
“ 腎臟是人體的重要器官，它的基本功能是生成尿液，借以清除體內代謝產物及某些廢物、毒物，同時經重吸收功能保留水分及其他有用物質，如葡萄糖、蛋白質、氨基酸、鈉離子、鉀離子、碳酸氫鈉等，以調節水、電解質平衡及維護酸堿平衡。腎臟同時還有內分泌功能，生成腎素、促紅細胞生成素、活性維生素D3、前列腺素、激肽等，又為機體部分內分泌激素的降解場所和腎外激素的靶器官。腎臟的這些功能，保證了機體內環境的穩定，使新陳代謝得以正常進行。”
腎臟需要滿足多樣化的生理功能，因而擁有了迷人的復雜結構。起初，對腎臟的研究僅限于宏觀觀察，其對腎臟疾病診斷的貢獻無疑是有限的。宏觀觀察描述了臨床表現，但潛在的發病機制卻無法解釋。腎臟生理學和病理生理學方面的成就很大程度上歸功于顯微鏡領域的持續進步。1666 年，解剖學家 Malpighi 用光學顯微鏡檢查了腎臟組織，該顯微鏡的放大倍率估計為 ×25-30，并首次將腎小球描述為“尿液與血液分離的腺體”。這一發現一直被忽視，直到 1842 年，William Bowman 才用更大放大倍率的光學顯微鏡解開了腎單位結構。Bowman 發現腎小球周圍囊（ Bowman 囊）在解剖學上與腎小管的第一部分相連 。1862 年，Jacob Henle 描述了以他的名字命名的環狀小管段，連接皮質小管和腎乳頭。由于引入了光學顯微鏡，腎臟疾病的組織形態學分類成為可能。觀察患病腎臟中發生的情況使人們能夠了解具有相似臨床表現的患者之間的病理變化有很大差異。然而，最初對腎組織病理變化的研究是在尸檢樣本上進行的，主要聚焦于對慢性疾病的描述，缺乏關于腎臟病理演變的信息，并且存在自溶現象的技術問題，限制了對腎臟疾病的進一步認識。1951 年，腎活檢的引入使得不僅可以直接觀察和研究慢性腎臟疾病，還可以直接觀察和研究急性腎臟疾病。與此同時，顯微鏡逐漸變得更加復雜，靈敏度和分辨率逐漸提高到納米級。在這篇綜述中，概述了顯微鏡技術的進步對腎臟基礎發現研究，尤其是新興技術發展演變帶來的可能性。
01研究結果
1、腎臟免疫病理學可視化
1.1 免疫標記和熒光顯微鏡
免疫熒光已被納入評估冷凍腎活檢標本的診斷程序中。主要用于腎小球腎炎、IgA 腎病，以及感染后腎小球腎炎和膜增生性腎小球腎炎。
1.2 共聚焦顯微鏡
共聚焦顯微鏡的引入，使熒光顯微鏡得到極大技術改進。共聚焦顯微鏡完成了第一次在實驗模型中對腎臟進行體內研究，并通過微穿刺后觀察熒光分子，允許在生理和病理條件下研究腎小管功能。
利用共聚焦顯微鏡沿 z 軸順序成像光學切片，及特定分析軟件對較厚組織標本進行 3D 渲染，可對 2D 分析進行糾正和補充。但共聚焦顯微鏡仍然無法分辨小于 200 nm 的細節。
圖1. 共聚焦顯微鏡、電子顯微鏡及多光子顯微鏡的成像及原理
2、腎小球濾過屏障：電子顯微鏡
1931 年，電子顯微鏡問世，因其使用加速電子束而不是光束作為激發源，進而達到了更高的分辨率—— 0.2 nm。由于分辨率的提高，很快就發現腎小球不僅僅是一個機械過濾器，而是一個三層組成的極其復雜的器官：內皮細胞、腎小球基底膜和足細胞。電子顯微鏡是一種強大的工具，不僅可以用于理解正常腎小球超微結構，還可以用于理解腎臟生理學和病理生理學。對人體樣本或實驗模型進行的大量研究表明，不同的疾病過程與一組獨特的超微結構改變模式相關，這意味著對腎臟疾病分類系統的進一步更新。
電子顯微鏡技術仍在不斷發展，塊面掃描電鏡允許對腎小球濾過屏障從 2D 視圖到 3D 視圖，其分辨率足以跟蹤健康小鼠、患病小鼠和腎臟發育過程中最薄細胞過程的納米結構。且電子顯微鏡可與X 射線顯微鏡耦合以在超微結構水平上對細胞或細胞部分進行元素分析。
3、使用多光子顯微鏡觀察腎臟生理
多光子顯微鏡為腎臟研究提供了進一步的進展，即同時實時研究腎功能和結構關系的可能性 。與傳統的光學顯微鏡不同，增加了深層組織滲透并最大限度地減少了光毒性。這使研究人員前所未有的直接在活體動物中可視化動態細胞過程。多光子顯微鏡允許量化基本腎功能和病理改變，例如腎小球通透性、血管血流量、單腎單位腎小球濾過率和腎小管流量 。此外，多光子顯微鏡允許研究響應損傷的細胞內過程，進一步的技術改進允許活體成像持續數天至數周。多光子顯微鏡也可以使用無標記成像技術，利用天然自發熒光來研究腎細胞的代謝狀態。
活體顯微鏡的最新創新是微型多光子內窺鏡，這種微創多光子顯微鏡可能為實時體內診斷鋪平道路，無需去除組織，而且時間很短。
4、3D 腎臟：組織清除技術和擴展顯微鏡檢查
腎組織不透明，使腎臟成為最具光學挑戰性的器官之一。組織清除技術的目的即是將不透明的組織轉換為透明的組織，保留蛋白質并最終保留熒光標記，以對厚組織切片進行成像。光學清除與最先進的顯微鏡相結合提供了形態測量分析的可能性，例如在厚組織甚至完整腎臟中量化腎小球體積和數量。其他應用包括分析不同的小管段、它們的功能和量化足細胞損失 。
為了對大量組織進行成像，同時解析精細的結構細節，最近還引入了另一種新的技術方法，即擴展顯微鏡 。這種技術是將整個器官物理擴展 4 到 5 倍，同時保留整體架構和 3D 蛋白質組內容。使用在樣品中直接合成的膨脹聚合物，與光的衍射極限相近的分子在空間中各向同性地分離到更遠的距離，因此即使通過傳統的熒光顯微鏡也可以進行光學解析。體積成像的進步允許對整個器官進行高分辨率 3D 分析，深度成像的主要限制現在表現為抗體穿透組織的能力。
5、代謝特征研究：頻域熒光壽命成像顯微鏡
腎臟是線粒體含量很高的代謝器官。NADH 的還原形式和其他代謝物具有天然熒光，這種自發熒光可用作氧化還原狀態的指標。然而，這些內源性熒光團的發射光譜是重疊的，不可能單獨識別它們。但是熒光壽命（即熒光的時間衰減）有顯著差異。因此，熒光壽命成像顯微鏡允許研究代謝特征。頻域熒光壽命成像顯微鏡有望為健康和疾病中的體內腎臟代謝提供進一步的見解。
6、突破極限：腎臟超分辨率成像
標準光學顯微鏡面臨 200 nm 的光學分辨率限制。作為納米顯微鏡時代的起點，超分辨率成像的新技術允許熒光顯微鏡成像超出其衍射極限。這些方法結合了納米級分辨率和多色熒光標記的優點。為表彰這些創新的潛在影響，2014 年諾貝爾化學獎授予 Eric Betzig、Stefan Hell 和 William Moerner，因為他們開發了超分辨熒光顯微鏡。不同的超分辨率成像策略可用于解決不同的生物學問題。這些方法可以分為兩大類，具體取決于超分辨率是在單分子水平還是在整體水平上。
圖2. STED顯微鏡原理及與共聚焦顯微鏡的成像對比
6.1 集成技術
基于集成的技術通過在時間和空間上調制激發光束來打破衍射極限。其中，超分辨率受激發射耗盡（STED）成像使用兩種激光，一種是激發激光器，另一種是疊加的紅移耗盡激光器（STED 激光器），呈甜甜圈形狀，以抑制熒光團的熒光發射位于激發的中心。這種抑制是通過受激發射實現的，并且只允許收集來自尺寸低于衍射極限的焦點的信號。
STED 顯微鏡需要用于樣品制備、特殊熒光團和技術培訓的特定實驗方法。出于這個原因，在過去幾年里，另一種超分辨率技術——結構照明顯微鏡 (SIM) 得到了更多的關注，它可以將衍射極限橫向和軸向擴展兩倍。SIM 使用具有細條紋照明圖案的寬視野顯微鏡設置，允許在較低空間頻率下捕獲高頻信息（對應于樣品中的精細細節）。通過獲取具有不同相位和方向的照明模式的多幅圖像，可以重建高分辨率圖像。SIM 與標準熒光團兼容，不需要特定的樣品制備并允許 3D 可視化。各種微小病變的成功識別，既表現出納米級病理的疾病改變的能力證實了 SIM 是一種很有前途的常規診斷工具。
6.2 基于單分子定位的成像方法
此類技術依賴于循環打開和關閉太近而無法解析的單個熒光分子的可能性。在這些方法中，衍射受限區域內的分子可以在不同的時間點被激活，以便它們可以單獨成像，然后通過計算找到它們的中心以納米精度定位。在這些方法中，隨機光學重建顯微鏡 (STORM) 于 2013 年首次引入腎臟研究，一項研究以納米精度揭示了 GBM 的復雜分子組織，包括分子的方向 。在罕見的先天性腎病綜合征的小鼠模型中，STORM 揭示了靜脈注射后 GBM 中層粘連蛋白 521 的整合和正確定向，為患者的高級治療選擇開辟了道路。另一項研究以分子尺度分辨率描述了足細胞中肌動蛋白細胞骨架的組織。
7、原子水平可視化基本生物分子 3D 結構：低溫電子顯微鏡
研究基本生物分子結構的可能性僅限于電子顯微鏡，因其具有極高的幾nm分辨率。但強電子束造成的樣品損壞、低圖像對比度和與電子相互作用后的分子運動或難以在電子顯微鏡室內施加的真空中保存生物樣品中的水分，使得無法解析低于此尺寸的分子。冷卻樣品可以減少水分蒸發和電子誘導的損傷。根據這個想法，低溫電子顯微鏡在 1950 年代被引入。
在腎臟研究中，基本蛋白質的結構是在原子水平上確定的，低溫電子顯微鏡正適用于此種場景。
8、了解腎臟疾病的分子基礎：整合腎臟顯微鏡
基質輔助激光解吸/電離成像質譜 (MALDI-IMS) 允許特異性且無標記地同時繪制組織中分子全譜圖，直接在組織切片上以高分辨率同時測量數百種不同的分子。在 MALDI-IMS 實驗中，冷凍或石蠟包埋的薄組織切片涂有吸收激光能量并促進組織分析物電離的基質。質譜儀中的分析為每個 x/y 坐標生成一個光譜。在 MALDI 測量之后，可以使用傳統的組織化學和免疫組織化學程序對同一組織切片進行染色，以將分子模式與組織學細節相結合。在腎臟研究中，MALDI-IMS 用于研究正常和患病組織中的藥物、代謝物、脂質、肽和蛋白質 。
MALDI-IMS 最常見的應用之一是鑒定分子標記以對腎細胞癌進行分類并在分子和組織學水平上確定癌組織和正常組織之間的真實界限。MALDI-IMS 也已成功用于研究腎臟藥物毒性，以提供由候選藥物介導的毒性腎臟損傷機制的早期檢測。此外，MALDI-IMS 用于研究脂質及其在腎臟病理學中的作用，如糖尿病腎病、急性腎損傷和多囊腎病，還用于揭示內源性代謝特征，以便更深入地了解疾病相關機制。還可用于確定生物標志物的分子圖譜，這些生物標志物可能是新的潛在診斷和預后生物標志物。
表1. 各類顯微成像技術對腎臟研究的適用方向
02 研究總結
腎臟生理和病理生理機制方面的重要成就很大程度上歸功于顯微鏡技術的進步。人們對腎臟結構的了解大部分是基于解剖顯微鏡師使用光學顯微鏡和后來通過電子顯微鏡提供的超微結構分析的基本描述。這兩種技術被用于腎臟疾病的第一個分類系統并不斷更新。當下，一系列新興的成像技術增加了對時間和空間維度的進一步分析。共聚焦顯微鏡使研究者能夠沿 z 軸順序可視化光學切片，并且特定分析軟件使較厚組織標本的三維渲染成為可能。多光子顯微鏡使研究者能夠同時實時進行腎功能研究和腎結構研究。熒光壽命成像顯微鏡可以研究代謝物的空間分布。超分辨率顯微鏡將靈敏度和分辨率提高到納米級。借助低溫電子顯微鏡，研究人員可以直接在組織中以原子水平觀察單個生物分子，并了解它們在亞細胞水平上的相互作用。最后，基質輔助激光解吸/電離成像質譜允許以高分辨率同時測量組織切片上的數百種不同分子。
成像技術的不斷改進逐步解決了腎臟研究中的許多關鍵技術障礙，并允許動態描繪正常和患病腎臟的結構和功能。新顯微鏡技術的出現促成了基礎科學發現，并隨之改變了人們對腎臟生理學和病理生理學的認識，如今可以進行 3D 可視化甚至進行視頻拍攝，增加了第四個觀察維度——時間。隨著超分辨率顯微鏡的最新技術創新和分子成像技術的進步，研究人員現在可以直接在組織中可視化單個生物分子，并確定它們如何在細胞和亞細胞水平上相互作用。將這些工具應用于病理腎臟標本，將側重于臨床活檢中的分子和亞細胞細節，未來會對疾病的重新分類帶來可能。
參考文獻：
1. Maria Lucia Angelotti, Giulia Antonelli, Carolina Conte, Paola Romagnani, Imaging the kidney: from light to super-resolution microscopy, Nephrology Dialysis Transplantation, Volume 36, Issue 1, January 2021, Pages 19–28, https://doi.org/10.1093/ndt/gfz136
