《Acta Biomater》：3D培養神經干細胞球狀體薄片移植改善腦損傷

對于輕度創傷性腦損傷（TBI）后的神經元功能障礙，目前尚無有效的臨床適用的治療方法。為此，韓國翰林大學Jin Pyeong Jeon教授及其團隊評估了一種新的使用水凝膠的小鼠神經干細胞（mNSC）球狀體傳遞方法的治療效果，以改善輕度創傷性腦損傷后的皮質損傷和認知障礙。采用水凝膠培養系統從心室下區和顆粒下區分離mNSCs。綠色熒光蛋白（GFP）轉導的mNSCs被生成球狀體，并包裹成薄片進行移植。將雄性C57BL/6J小鼠隨機分為4組：假手術、TBI、TBI加mNSC球狀體移植、TBI加mNSC球狀體薄片移植。在創傷后移植后7、14和28天評估組織病理學和免疫組化特征和認知功能。從成年小鼠中成功建立了水凝膠培養系統和mNSC分離。NSCs的必需轉錄因子在mNSCs中高表達，如SOX2、PAX6、Olig2、巢蛋白和雙皮質素（DCX）。移植的水凝膠基mNSC球狀體薄片具有良好的移植和存活能力，分化為TUJ1陽性神經元，促進血管生成，減少神經元變性。此外，接受mNSC球狀體薄片移植治療的TBI小鼠對新物體的偏好顯著增加，表明與mNSC球狀體或未接受治療的組相比，認知功能得到改善。因此，水凝膠mNSC球狀體薄片移植顯示腦外傷后傳遞細胞在惡劣微環境中的移植、遷移和穩定性，通過重建受損皮質，改善認知功能。

相關研究內容以“Therapeutic effect of a hydrogel-based neural stem cell delivery sheet for mild traumatic brain injury”為題于2023年6月23日發表在《Acta Biomater》期刊。
 
培養1周后確認mNSCs的出現，然后從腦組織碎片持續增殖和遷移到水凝膠中（圖1A）。采用選擇水凝膠裂解法分離出水凝膠中的高密度mNSC，并采用matrigel包覆的2D培養法成功傳代（圖1B）。通過集落形成單元（CFU）實驗，三種培養物均證實了mNSCs的自我更新能力（圖1C、D）
 
分離的mNSCs通過SVZ和SGZ中以特異性的NSCs標記物表達（圖2A)。流式細胞術分析顯示，大量的mNSCs表達SOX2、巢蛋白、PAX6、DCX和Olig2。當使用大腦中存在的幾種成熟細胞標記物來確認分離的mNSCs的純度時，神經元、星形膠質細胞、平滑肌細胞和小膠質細胞/巨噬細胞的標記物只顯示出很少的表達（圖2B-D）。
 
通過3D構建來考慮表型、粘附和代謝的影響。免疫熒光染色結果顯示，2D單層條件下的mNSCs的微管蛋白、beta3III類（TUJ1）、微管相關蛋白2（MAP2）、膠質纖維酸性蛋白（GFAP）和Olig2均呈陽性（圖3A）。在3D球形條件下，其表達水平升高。其中NeuN和S100B表達明顯，提示終末分化的神經元、星形膠質細胞或少突膠質細胞或少突膠質細胞（圖3B）。RT-PCR結果顯示，分化的mNSCs在3D球狀體條件下的mRNA水平升高（圖3C）。mNSC SP具有連續遷移/入侵水凝膠的能力，利用轉換后的8位圖像的面積測量來估計遷移/入侵距離（圖3D、E）。
 
在本研究中，使用慢病毒增強的綠色熒光蛋白（EGFP）跟蹤系統評估移植的mNSC球狀體在損傷病變中的植入、分化和重建（圖4A）。慢病毒感染3天后，大多數mNSCs顯示GFP表達，沒有形態學變化，并形成球狀體（圖4B）。根據每個細胞數的直徑，確定球狀體的最佳細胞數在1000~2000個細胞之間（圖4C、D）。為了在大規模上生成均勻的球狀體，推薦直徑約為100 μm，根據細胞數量優化了培養條件（圖4E）。作者觀察了mNSC在水凝膠中的遷移和球狀體之間的神經網絡結構（圖4F）。
 
與TBI和原位凝膠小鼠相比，GFP陽性的mNSCs在損傷的皮質中存活了7、14和28 天，這表明通過mNSC球狀體薄片移植可以防止大規模的細胞丟失（圖5A、B）。在沿胼胝體的海馬額葉區也觀察到GFP陽性的mNSCs，表明其具有體內遷移能力（圖5C）。宿主組織的皮質神經元和星形膠質細胞被整合并相互作用，引導移植的mNSCs的軸突生長（圖5D）。mNSC SP片可以存活并支持神經元細胞在移植后28天內存活（圖5E）。
 
在測量學習和記憶的NOR測試中，與mNSC SP組的mTBI小鼠在7 DPT和28 DPT時新物體探索的頻率顯著增加（圖6A、B）。與使用mNSC SP組的mTBI或mTBI組相比，使用mNSC球狀體薄片移植的mTBI小鼠在移植后7 、14和28 天，新物體探索的頻率顯著增加（圖6A、B）。Y-迷宮試驗還顯示，與mNSC SPs移植組相比，使用mNSC球狀體薄片移植組的mTBI小鼠在移植后7 天，新臂進入的交替數量顯著增加（圖6C、D）。這些數據表明，mNSC球狀體薄片移植可能比mNSC SP移植更有助于改善認知損傷。

綜上所述，本研究建立了一個在膠原/纖維蛋白水凝膠中來自成人mNSCs的NSCs的3D培養系統。膠原蛋白和纖維蛋白可以用于創傷后的中樞神經系統（CNS）修復，因為它們具有高度的生物相容性、可生物降解和無毒。本研究表明盡管存在惡劣的微環境，水凝膠mNSC球狀體薄片的移植顯示了損傷皮質病變中傳遞細胞的移植、遷移和穩定性。水凝膠mNSC球狀片可以通過重建創傷性腦損傷后受損皮質，為受損認知功能的恢復提供有前途的治療。

文章來源：
https://doi.org/10.1016/j.actbio.2023.06.027