EVIDENT共聚焦/超分辨助力Nature發文揭示應激顆粒亞型鑒定范式
本文作者：尚澤華
四川大學生物治療全國重點實驗室賈大課題組
應激顆粒（SGs）是真核細胞在應對缺氧、熱休克、病毒感染和氧化應激等各種應激時形成的無膜 RNA 顆粒1。SGs 的形成會導致細胞新陳代謝的重新規劃、翻譯的抑制以及正常細胞信號的改變，從而幫助細胞存活。SG 是通過一種稱為液-液相分離（LLPS）的物理過程形成的，其中包含許多蛋白質，包括小核糖體亞基、翻譯起始因子、翻譯受阻的 mRNA 和 RNA 結合蛋白2。最近發現了一個由 36 個 SG 蛋白組成的核心 SG 網絡，其中 G3BP1/2 是中心節點3。這些蛋白對調節 SG 的組裝和功能至關重要。在許多病理情況下，如病毒感染4-8、神經退行性疾病9-11和癌癥12、13等，SG的組裝和分解失調都會發生，這突出了SG在人類疾病中的重要性。最近的研究發現，不同類型的應激會誘導不同的 SG 亞型，這些亞型在組成、組裝和解體的動態以及細胞功能方面各不相同14。例如，亞砷酸鈉或熱休克處理會誘導形成典型的 SG，這種 SG 更具有活力，能起到促進生存的作用15。與此相反，亞硒酸鈉等化療藥物或紫外線照射會導致非典型 SG 的形成，這種 SG 的動態性較弱，對細胞有促進凋亡的作用15、16。盡管應激特異性 SG 亞型的概念正在形成7、15、17-19，但它們不同的蛋白質和 RNA 組成及功能在很大程度上仍未得到探索。
2024年5月15日，四川大學生物治療全國重點實驗室賈大課題組與合作者在Nature communications雜志( IF=16.6 (2023) / JCR分區: Q1 )在線發表了題為“TRIM25 predominately associates with anti-viral stress granules“ 的研究論文。該工作利用 G3BP1 鄰近蛋白生物素化標記實驗發現 TRIM25 是抗病毒 SG 的有效標記物。課題組成員發現 TRIM25 會獨立發生 LLPS 現象，而 dsRNA 的存在會顯著增強這種反應。Poly(I:C)處理和RNA病毒感染都會引發TRIM25和G3BP1的共相分離，從而顯著提高TRIM25對底物的泛素化活性，其中許多底物都定位于SGs中。TRIM25和G3BP1的共相分離對激活RIG-I信號通路和限制RNA病毒感染至關重要。該研究不僅為抗病毒信號通路的調控提供了新的見解，而且為研究應激特異性 SG 亞型的組成、動態和功能建立了一個研究范式。
該研究首先采用了一種鄰近生物素化標記（BioID）方法（圖1）來鑒定poly(I:C)刺激下的 G3BP1 相互作用網絡。在 937 個差異蛋白中，有 181 個屬于以前鑒定的 SG 蛋白成分，包括許多 SG 核心蛋白，如 HDAC6 和 DDX3X。有趣的是，TRIM25在所有蛋白中增加最為顯著，它是一個泛素化依賴性抗病毒先天免疫反應的驅動蛋白，經 poly(I:C) 處理后富集了 130 倍（圖1）。這意味著，poly(I:C) 處理會刺激 TRIM25 被招募到 SG（即抗病毒 SG）中。
(A) G3BP1 BioID 方法與基于 TMT 的定量蛋白質組學相結合的示意圖。(B) 如(A)中所確定的，由 poly(I:C) 處理誘導的 SGs 核心蛋白列表。
(A) 具有代表性的熒光顯微鏡圖像顯示了在各種應激條件下 TRIM25 與 HeLa 細胞中內源性 G3BP1 的共定位。(B) TRIM25 和 G3BP1 病灶之間的最短距離。在 HeLa 細胞中，各種應激類型如（A）所示。在所有應激類型中，Sev 感染和 poly(I:C) 處理導致的距離最短。
(A) 轉染 poly(I:C) 后 G3BP1（綠色）和 TRIM25 WT 或 ∆PTFG （紅色）點狀顆粒形成的延時顯微照片，以及轉染后 6 小時或 10 小時斑點的放大圖像。比例尺：10 µm。插圖：白色框內區域的放大圖。(B) TRIM25 的 PTFG 基序是與 HeLa 細胞中的 G3BP1 共定位所必需的。細胞轉染了 GFP-TRIM25 ∆PTFG 而不是 TRIM25 WT。比例尺：10 μm。
(A-D) 用 TRIM25 WT、TRIM25 PTFGAAAA或∆PTFG轉染HEK293T細胞，然后用poly(I:C) 處理 12 小時。用qPCR測定IFNα (A)、IFNβ (B)、IFNγ (C)和ISG56 (D)的 mRNA 水平。
本文中多色熒光標記的細胞圖像都是采用Evident激光掃描共聚焦FV3000拍攝。FV3000的全真光譜技術可以自由調整標記熒光信號的收集波段，并有效防止不同標記之間的熒光串擾，幫助用戶獲取更加真實可靠的數據。另外，本文還利用FV3000觀察了活細胞中的G3BP1液滴以及通過FRAP實驗驗證了其相分離特性。FV3000靈活高效的龍卷風光刺激模式以及追蹤運動中的液滴并分析其漂白區域熒光強度變化的功能，是幫助用戶進行相分離研究的利器。（Evident新一代激光掃描共聚焦系統FV4000現已發布。）
文章中的活細胞實驗采用了Evident轉盤共聚焦超分辨系統SpinSR，其高速、高分辨率和低光毒性的特點，適合對快速動態變化的活細胞進行長時程觀察。
四川大學生物治療全國重點實驗室賈大研究員與四川大學基礎與法醫學院Peng Bai為本文的共同通訊作者。碩士生尚澤華，博士生張思韜、王瑾瑞為本文共同第一作者，蘇州大學博士生周莉莉、四川大學華西生物治療國重創新班本科生張欣悅也為本研究做出重要貢獻。本研究還得到了周芳芳、楊培國、Daniel D. Billadeau、張令強等教授的大力支持，并得到了李丕龍教授的指導和幫助。
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